基因扩增仪（ＰＣＲ仪）百科知识

一、定义与基本原理

基因扩增仪（ＰＣＲ仪）是一种通过聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ，　ＰＣＲ）技术，在体外快速扩增特定ＤＮＡ片段的仪器。其核心原理是通过精确控制温度循环，模拟ＤＮＡ自然复制的条件，实现目标ＤＮＡ的指数级扩增。

基本步骤：

1. 变性（９０–９８℃）：双链ＤＮＡ解链为单链。

2. 退火（５０–６５℃）：引物与单链ＤＮＡ互补结合。

3. 延伸（７２℃）：ＤＮＡ聚合酶以单链为模板合成新链。

二、主要类型

1. 普通ＰＣＲ仪

• 功能：仅完成ＤＮＡ扩增，需通过凝胶电泳检测结果。

• 应用：克隆、基因筛查等基础实验。

2. 实时定量ＰＣＲ仪（ｑＰＣＲ）

• 染料法（如ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ）：结合双链ＤＮＡ发光。

• 探针法（如ＴａｑＭａｎ）：特异性探针标记荧光。

• 特点：集成荧光检测系统，实时监测扩增进程，通过荧光信号强度定量初始ＤＮＡ量。

• 类型：

• 应用：病毒载量检测（如新冠病毒）、基因表达分析。

3. 数字ＰＣＲ仪（ｄＰＣＲ）

• 原理：将样本分割为数千个微反应单元，统计阳性信号，实现绝对定量。

• 优势：高灵敏度、抗干扰能力强，适用于低丰度靶标（如循环肿瘤ＤＮＡ）。

三、仪器结构与组成

• 温控系统：核心部件，通过帕尔贴模块实现快速升降温。

• 热盖：防止反应液蒸发，减少冷凝。

• 检测模块（ｑＰＣＲ／ｄＰＣＲ）：荧光检测器或微流体芯片。

• 用户界面：触摸屏或电脑软件，用于编程和数据分析。

四、工作流程

1. 准备反应体系：ＤＮＡ模板、引物、ｄＮＴＰｓ、聚合酶、缓冲液。

2. 设置程序：设定变性、退火、延伸的温度与时间，循环次数（通常２５–４０次）。

3. 运行与检测：普通ＰＣＲ需后续电泳；ｑＰＣＲ／ｄＰＣＲ实时或终末检测。

五、核心应用领域

• 医学诊断：病原体检测（ＨＰＶ、ＨＩＶ）、遗传病筛查（唐氏综合征）、癌症基因突变分析。

• 基础科研：基因克隆、表达谱研究、表观遗传学（如甲基化检测）。

• 法医学：ＳＴＲ分型用于个体识别、亲子鉴定。

• 农业与食品：转基因作物检测、食源性致病菌鉴定（如沙门氏菌）。

六、选型指南

• 样本通量：

• 低通量（９６孔）：小型实验室。

• 高通量（３８４孔或芯片）：临床检测中心。

• 检测需求：

• 定性分析：普通ＰＣＲ。

• 定量需求：ｑＰＣＲ（相对定量）或ｄＰＣＲ（绝对定量）。

• 预算：ｄＰＣＲ　＞　ｑＰＣＲ　＞　普通ＰＣＲ，需考虑耗材成本（如探针费用）。

七、维护与故障处理

• 日常维护：

• 清洁样品槽，避免交叉污染。

• 定期校准温度（使用外部温度探头验证）。

• 常见问题：

• 无扩增产物：检查引物设计、聚合酶活性。

• 非特异性条带：优化退火温度，使用热启动酶。

• 荧光信号异常（ｑＰＣＲ）：检查探针降解或光路污染。

八、技术发展趋势

1. 快速ＰＣＲ：微流控技术将反应时间从小时级缩短至分钟级（如１５分钟完成扩增）。

2. 便携化：手持式ＰＣＲ仪用于现场检测（如病原体野外监测）。

3. 多组学整合：与ＣＲＩＳＰＲ结合（如ＳＨＥＲＬＯＣＫ技术），或连接测序平台（ＰＣＲ－ｆｒｅｅ文库制备）。

九、注意事项

• 防污染措施：

• 分区域操作（试剂准备区、样品处理区、扩增区）。

• 使用ＵＮＧ酶降解残留ＤＮＡ。

• 数据解读：

• ｑＰＣＲ需设置内参基因校正（如ＧＡＰＤＨ）。

• ｄＰＣＲ注意分区效率对定量结果的影响。

以上内容涵盖基因扩增仪的技术原理、应用场景及最新进展，为科研、医疗及工业用户提供全面的参考信息。实际使用中需结合实验目的和操作规范，确保结果准确性。

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